当时刘备刚被曹操打败，正想带兵马南渡长江，在当阳遇上鲁肃，两人就一起商量对策，随后进驻夏口，刘备派诸葛亮去见孙权求救。孙权于是派周瑜、程普等人和刘备联军，在赤壁迎击曹操。这时曹操军中已经出现疫病，刚一交战，曹军就败退下来，退到长江北岸扎营。周瑜等人在南岸驻军，他的部将黄盖建议：“现在敌众我寡，没法长期对峙。但我看曹操的战船首尾相连绑在一起，可以用火攻把他们赶走。” 于是挑选了几十艘蒙冲斗舰，装满柴草，浇上油脂，外面用帷幕遮住，船上插着军旗，黄盖先写信给曹操，假意要投降。（《江表传》记载了黄盖的信：“我受孙氏厚恩，常年担任将领，待遇不薄。但天下大势明摆着，用江东六郡的山越兵，对抗中原百万大军，众寡不敌是天下人都看到的。江东将士无论聪明还是愚笨，都知道这行不通，只有周瑜、鲁肃偏怀浅见，执迷不悟。今天我真心归顺，这是最实在的打算。周瑜统领的军队，很容易打败。交战那天，我做前锋，到时见机行事，马上就能为您效力。” 曹操特意召见送信的人，秘密盘问，口头吩咐说：“只怕你是诈降。黄盖要是真心投降，我一定封爵赏赐，比以往任何人都优厚。”）
黄盖又准备了轻便的快船，都系在大船后面，依次向前推进。曹军将士都伸着脖子观望，指着船队说黄盖来投降了。黄盖下令点燃所有战船，当时东南风正急，火船像箭一样冲向曹军，很快就烧到岸上的营寨。转眼间，火光浓烟遮天蔽日，曹军士兵战马被烧死淹死的不计其数，军队大败后退，退保南郡。（《江表传》记载：交战当天，黄盖先选了十艘轻便快船，装满干燥的芦苇和枯柴，浇上鱼油，用红色帐幔盖住，船上插着旌旗龙幡。当时东南风刮得正急，这十艘船排在最前面，到江心升起船帆，黄盖点火后通知各营，让士兵齐声大喊：“投降啦！” 曹军将士都出营围观。距离北岸曹军还有两里多远时，十艘船同时点火，火势借着风威迅猛蔓延，火船像飞箭般冲向敌营，火星飞溅，烧光了曹军的战船，火焰还蔓延到岸边的营寨柴草。周瑜等人率领轻装精锐随后冲锋，擂鼓呐喊大举进攻，曹军彻底溃败，曹操仓皇逃走。）刘备和周瑜等人又率军追击，曹操留下曹仁等人驻守江陵城，自己径直退回北方。
周瑜和程普又进军南郡，与曹仁的军队隔长江对峙。双方还没正式交战时，（《吴录》记载：刘备对周瑜说：“曹仁驻守江陵城，城里粮食充足，这对我们是很大的威胁。让张飞率领一千人跟随您，您分两千人给我，我从夏水攻入截断曹仁的后路，曹仁听说我攻进去必定会逃走。” 周瑜就拨了两千人补充给刘备。）周瑜立即派甘宁先去占据夷陵。曹仁分出一支骑兵单独围攻甘宁，甘宁向周瑜告急。周瑜采用吕蒙的计策，留下凌统防守后方，自己和吕蒙率军西进救援甘宁。甘宁的围困解除后，周瑜率军渡过长江在北岸屯驻，约定日期与曹仁大战。交战时周瑜亲自骑马冲锋陷阵，不巧被流箭射中右肋，伤势很重，只好退回营中。后来曹仁听说周瑜卧床不起，就率军逼近营寨挑战。周瑜强撑着起身，巡视军营，激励将士们，曹仁因此只好退兵。
孙权任命周瑜为偏将军，兼任南郡太守，把下隽、汉昌、刘阳、州陵四个县作为他的奉邑，让他驻守江陵。刘备以左将军的身份兼任荆州牧，治所设在公安。刘备到京口拜见孙权时，周瑜上疏说：“刘备有枭雄的野心，又有关羽、张飞这样熊虎般的猛将，肯定不会长久屈居人下听人指挥。我认为最好的办法是把刘备迁到吴郡安置，为他大修宫殿，多送美女珍宝让他沉迷享乐，消磨他的斗志；再把关羽、张飞分开，各安置在不同地方，让像我这样的将领能统率他们作战，这样大事就能平定了。现在轻率地割让土地来资助他们，让这三人聚在边境，恐怕就像蛟龙得到云雨，终究不会再是池中之物了。” 孙权因为曹操还在北方威胁，正需要广揽英雄，又担心刘备不好控制，所以没有采纳周瑜的建议。
当时刘璋担任益州牧，外面有张鲁的侵扰，周瑜就到京口拜见孙权说：“现在曹操刚遭受挫败，正担心内部不稳，没精力跟将军您交战。请允许我和奋威将军孙瑜一起进军攻取蜀地，得到蜀地后再吞并张鲁，留下奋威将军驻守那里，与马超结盟求援。我回来和将军占据襄阳对抗曹操，这样就能图谋北方了。” 孙权批准了这个计划。周瑜返回江陵准备行装，却在途中的巴丘病逝，（臣松之考证：周瑜想攻取蜀地，返回江陵整理行装，去世的地方应该是现在的巴陵，和之前驻守的巴丘，名称相同但地点不同。）年仅三十六岁。
孙权穿上素服为他举哀，悲痛之情感动了身边的人。周瑜的灵柩要运回吴郡时，孙权又亲自到芜湖迎接，丧事的所有费用，都由官府供给。后来孙权还下令：“已故将军周瑜、程普的家客，都不用缴纳赋税徭役。” 当初周瑜和孙策结为好友，孙策的母亲吴太妃又让孙权像对待兄长一样尊敬周瑜。那时孙权还只是将军，众将和宾客对他的礼节还比较简单，只有周瑜率先对他毕恭毕敬，行臣子的礼节。周瑜性格气度宽宏，很得人心，只是和程普关系不好。
（《江表传》记载：程普因为自己年纪大，多次欺辱周瑜。周瑜却降低身份包容他，始终不与他计较。程普后来对周瑜十分敬佩亲近，告诉别人说：“和周公瑾交往，就像喝醇厚的美酒，不知不觉就醉了。” 当时的人都佩服周瑜的谦让品德。起初曹操听说周瑜年轻有才，认为可以派人游说拉拢他，就秘密下令扬州刺史，派九江人蒋干去见周瑜。蒋干仪表堂堂，以才学口才闻名，在江淮一带没人能比得上他。蒋干换上布衣葛巾，以私人名义去拜访周瑜。周瑜出来迎接，见面就说：“子翼辛苦了，远涉江湖来为曹操做说客吗？” 蒋干说：“我和您是同乡，分别已久，听说您的美名，特意来叙旧，顺便看看您的风采，怎么能说我是说客呢，这不是太猜疑人了吗？” 周瑜说：“我虽然比不上夔、旷那样的乐师，但听弦音就能知道乐曲好坏。” 于是请蒋干进城，设宴款待。饭后周瑜对他说：“我刚好有机密大事要处理，您先去馆舍休息，事情办完后，再单独请您。” 三天后，周瑜请蒋干参观军营，查看仓库和武器装备后，又设宴招待，席间展示侍者的服饰和珍玩，对蒋干说：“大丈夫活在世上，遇到知己的君主，对外是君臣关系，对内有骨肉般的恩情，言行都被采纳，祸福共同承担，就算苏秦、张仪重生，郦食其再现，我也会拍着他们的后背驳回说辞，难道是您这种年轻人能说动的吗？” 蒋干只是微笑，始终没敢多说。蒋干回去后，称赞周瑜气度高雅，不是言辞能离间的。中原的士人，也因此更加敬重周瑜。刘备从京口返回公安时，孙权乘坐飞云大船，和张昭、秦松、鲁肃等十多人一起送行，举行盛大宴会告别。张昭、鲁肃等人先离开后，孙权单独和刘备留下谈话，言谈间感叹说：“公瑾文武双全，是万人中的英才，只是他器量太大，恐怕不会长久做臣子啊。” 周瑜打败魏军后，曹操说：“我撤退并不觉得羞耻。” 后来写信给孙权说：“赤壁之战，正好赶上军队闹病，我自己烧毁战船撤退，反倒让周瑜白白得了这个名声。” 周瑜的威名远扬，所以曹操、刘备都想挑拨离间诋毁他。周瑜去世后，孙权流着泪说：“公瑾有辅佐帝王的才能，现在突然短命去世，我以后依靠谁呢！” 后来孙权称帝时，对公卿大臣说：“我如果没有周公瑾，就不能称帝了。”）
周瑜年轻时对音乐很有研究，即使喝了很多酒，只要乐曲有错误，他一定能听出来，听出来后必定会回头看演奏者，所以当时有歌谣说：“曲有误，周郎顾。”
周瑜有两个儿子一个女儿。女儿嫁给了太子孙登。长子周循娶了公主为妻，被任命为骑都尉，性格作风很有周瑜当年的风采，可惜年纪轻轻就去世了。周循的弟弟周胤，起初被任命为兴业都尉，孙权把宗室女子嫁给她做妻子，拨给他一千名士兵，驻守在公安。黄龙元年，周胤被封为都乡侯，后来因为犯了罪被贬到庐陵郡。